Получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты
Для конструирования рекомбинантных РНК или ДНК необходимо получить фрагмент нуклеиновой кислоты, который в дальнейшем и будет встраиваться в векторную молекулу.
Фрагменты ДНК для встраивания в вектор можно получить непосредственно из хромосомной ДНК, расщепив ее рестриктазами или разрушив случайным образом (например, с помощью ультразвука) на сегменты с примерно одинаковой длиной. Выделение генов с помощью "вырезания" из генома, как правило, состоит из четырех этапов: 1) получение клонотеки фрагментов генома; 2) выявление фрагментов генома, содержащих необходимый ген, и точная локализация гена в данном фрагменте; 3) вырезание гена из фрагмента(ов) с помощью рестриктаз и сшивка участков гена с помощью ДНК-лигазы фага Т4, если эти участки получены из различных фрагментов; 4) амплификация гена в составе векторной молекулы. Указанный способ получения генов является наиболее приемлимым применительно к протозойным возбудителям, бактериям и для некоторых сложно устроенных ДНК-содержащих вирусов. Такие операции проводятся, в частности, при создании так называемых "библиотек генов", то есть набора одинаковых векторных систем, в совокупности несущих в себе весь геном данного организма. Однако этот подход имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, очень сложна задача подбора рестриктаз, позволяющих вырезать из геномной ДНК или клонированного фрагмента генома цельный ген. Как правило, вместе с геном остаются фланкирующие его лишние нуклеотидные последовательности, что мешает дальнейшему использованию этого гена, или же рестриктазы отрезают часть гена, делая его функционально неполноценным. Во-вторых, создание клонотеки генома возбудителя представляет специальную задачу и требует больших затрат времени. Наконец, для ряда ДНК-содержащих вирусов (паповавирусы) доказан сплайсированный характер структуры генов. Вполне понятно, что выделенные гены этих вирусов вследствие наличия интронных областей не будут проявлять функциональной активности в бактериальных клетках и окажутся непригодными при решении задач по конструированию рекомбинантных противовирусных вакцин. В-третьих, если ген составляет незначительную долю от всей геномной ДНК, то возникают большие трудности с его изоляцией и идентификацией.
Наиболее распространенным является путь получения генов через синтез ДНК-копий (кДНК) информационных или каких-либо других (в оптимальном случае - индивидуальных) РНК путем их обратной транскрипции. Данный способ включает в себя три этапа: 1) выделение высокоочищенных мРНК, кодирующих индивидуальные структурные белки, либо выделение геномных РНК вирусов; 2) синтез двухцепочечной ДНК (гена) на матрицах РНК; 3) амплификация гена с помощью методов молекулярного клонирования.
Как отмечалось, первым этапом в получении генов с помощью методов обратной транскрипции служит выделение и очистка геномных РНК и мРНК. Геномные РНК выделяют главным образом из очищенных вирионов, а мРНК - из инфицированных клеток. Для выделения мРНК из инфицированных клеток используют различные способы. В одном из вариантов выделение мРНК из инфицированных клеток проводят непосредственно из лизированных клеток (лизис осуществляют в денатурирующих средах в целях предотвращения разрушающего действия нуклеаз на мРНК) с последующей экстракцией фенолом и хлороформом или центрифигурированием лизата через подушку 5,7M СsCl (для освобождения от клеточных ДНК) и заключительной аффинной хроматографией на олиго(dТ)-целлюлозе (поли(У)-сефарозе). Выделение мРНК можно проводить и из очищенных полирибосом инфицированных клеток.
