Питательные среды.
В любой клеточной культуре различают клеточную и жидкую фазы. Жидкая фаза обеспечивает жизнедеятельность клеток культуры и представляет собой питательные среды различного состава и свойств.
Все среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя на поверхности стекла или достаточно высокую концентрацию клеточных элементов в суспензии (при получении суспензионных культур). Поддерживающие среды фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетках вирусных агентов.
Ростовые и поддерживающие среды многокомпонентны. В их состав могут входить как естественные продукты (амниотические жидкости, сыворотки животных), так и субстраты, полученные в результате частичной обработки естественных продуктов (эмбриональные экстракты, гидролизат лактальбумина, гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические химически чистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).
В качестве примера питательной среды, полностью состоящей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для выращивания клеточных культур из почечного эпителия обезьян. В эту среду входит коровья амниотиче-ская жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) и коровий эмбриональный экстракт (5%).
Все естественные продукты малостандартны, их использование связано с большой опасностью микробной и вирусной контаминации клеточных культур. В связи с этим и происходит постепенное вытеснение их синтетическими стандартными смесями. Наибольшее применение находят синтетическая среда 199 и среда Игла. Широко используются среды, содержащие строго определенные количества солей, аминокислот и витаминов.
Независимо от назначения все питательные среды для тканевых культур конструируются на основе какого-либо сбалансированного солевого раствора с достаточной буферной емкостью. Чаще всего ими являются растворы Хенкса и Эрла. Эти растворы — обязательный компонент любой питательной среды. Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5—10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит.
Включение сыворотки в то же время препятствует созданию ростовых сред точного химического состава, весьма важных для развития фундаментальных исследований по клеточной физиологии, так как вместе с сывороткой (или ее дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемых факторов, варьирующих в зависимости от серии сыворотки.
В 50-е годы Ewans и Waymouth были предложены бессывороточные среды точного химического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех показателей пролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды с добавлением сывороток. В связи с этим представляет интерес работа Birch и Pirt, показавших, что для обеспечения интенсивного роста клеток в бессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей Fe, Zn, Cu, а также МnС12.
В ростовые питательные среды, а так же в буферный раствор для промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в среду непосредственно перед употреблением из расчета 1 мл основного раствора антибиотиков на 500 мл среды.
Ниже приведен состав и метод приготовления одной из распространенных питательных сред.
Среда Игла
1. л-аргинина - 17,4
2. л-цистина - 4,8
3. л-гистидина - 3,1
4. л-изолейцина - 26,2
5. л-лейцииа - 13,1
6. л-лизина - 14,6
7. л-метионина - 7,5
8. л-фенилаланина - 8,3
9. л-треонина - 11,9
10. л-триптафана - 2,0
11. л-тирозина - 18,1
12. л-валина - 11,7
13. биотина - 0,24
14. холина - 0,12
15. холин-хлорида - 0,14
16. витамина В12 (птероилглютаминовой кислоты) - 0,44
17. никотинамида - 0,12
18. пантотеновой кислоты - 0,22
19. пантотената кальция - 0,48
20. пиридоксаля (пиридоксин хлоргидрата) - 0,20
21. тиамин-хлоргидрата - 0,34
22. рибофлавина - 0,04
23. хлористого натрия - 5850,0
24. хлористого калия - 373,0
25. фосфата натрия однозамещенного (NaH2PO4 . Н2О) - 138,0
26. кальция хлористого - 111,0
27. двууглекислого натрия (NaHCO3) - 1680,0
28. магния хлористого (MgCl2 . 6Н2О) - 102,0
29. глюкозы - 900,0
30. л-глютамина - 146,2—292,3
31. пенициллина - 50,0
32. стрептомицина - 50,0
33. фенола красного - 5,0
34. воды до 1000,0
Приготовление.
1 2