Общие принципы проточной цитометрии
Метод проточной цитометрии сформировался за последние 30 лет на основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их размеров. В 1965 г. появилось первое сообщение о клеточном сортере, а в 70-х годах стали выпускать приборы, способные измерять интенсивность флуоресценции при двух и более длинах волн и определять сразу несколько клеточных параметров.
В настоящее время выпускают два основных типа приборов для проточной цитометрии: 1) простые в использовании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10º (малоугловое прямое рассеяние) и 90º; 2) большие клеточные сортеры, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с заданным набором этих параметров.
Принципы проточной цитометрии весьма просты. Клетки или ядра поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. Свет определенной длины возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации.
Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные: определять содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество белков и количество специфических белков, узнаваемых моноклональными антителами, исследовать клеточный метаболизм (например, измерять внутриклеточный рН), изучать транспорт ионов кальция и кинетику ферментативных реакций (M.G.Ormerod, 1990).
В продаже имеются разные проточные цитометры, и изложить общие принципы их работы сложно. Можно отметить лишь несколько моментов, общих для всех приборов:
– для анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток;
– клетки или ядра должны иметься в достаточном количестве;
– для устранения эффектов, связанных с возможной агрегацией клеток, необходимо использовать всю доступную информацию, например данные по рассеянию света в объеме и отношение площади пика к его ширине.
