Подготовительные этапы перед проведением слияния

Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы:

ﭼ иммунизация животных;

ﭼ подготовка клеток к слиянию;

ﭼ слияние;

ﭼ отбор индуцирующих специфические антитела клонов;

ﭼ клонирование и реклонирование;

ﭼ массовая наработка гибридомных клеток;

ﭼ получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;

ﭼ выделение антител.

Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3-4 месяца.

Организация работы и оборудование.

Для работы по получению гибридом желательно выделить отдельное помещение. Эксперимент можно проводить и в части большой комнаты, максимально удаленной от входной двери. Это помещение надо оснастить следующим оборудованием:

1. Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих частицы крупнее 0,3 мкм.

2. Инкубатор, в котором автоматически поддерживается влажность, температура и концентрация СО2.

3. Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно с охлаждением.

4. Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-констрастным устройством.

5. Холодильник на +4 и на –200 С.

6. Водяная баня на +37 и +560 С.

Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь морозильник на –700 С и сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения клеток. Для получения гибридом нужно приобрести также специальную пластиковую посуду для культуры клеток: 96-луночные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с площадью роста 25, 75 см2 и др., пластиковую посуду для проведения иммуноферментного и радиоиммунологического анализов, среды для культивирования, необходимые реактивы, сыворотку плода коровы (СПК).

Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования.

Основными средами, употребляемыми для получения гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности, среда Дульбекко в модификации Иксова. Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.

Выбор экспериментального животного

. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных.

Другие животных практически не используются.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно осложняет отбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной детерминанте, так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере на последних этапах иммунизации. Одним из основных достоинств гибридомной техники и является как раз то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и употребив впоследствии эти антитела для очистки антигена.

Способы иммунизации.