Неудачи экспериментов с мышами.

Другая статья Илменсе и Хоппе имела ещё больший резонанс. Авторы сообщили о пересадки ядер внутренней клеточной массы бластулы в энуклеированные зиготы мышей и получения трёх взрослых особей (двух самок и одного самца), генетически идентичной донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один приём, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии бластулы и пересаживали в матку самок. Из 16 пересаженных бластул три развились во взрослые особи. В следующей работе эти же авторы использовали в качестве доноров-ядер клетки эмбрионов ещё более поздней стадии (семь суток) и будто бы получили трёх половозрелых мышей. Однако никто из работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и достоверность результатов Илменсе и Хоппе вновь была поставлена под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластулы не обеспечивают развития in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластулы. Наибольшая часть (5%) 4-клеточных зародышей даёт возможность развиваться только до стадии морулы. В тоже время 19% реконструированных яйцеклеток 2-ядерных клеточных зародышей, смогли спокойно достичь стадии морулы или бластулы.

Эти и другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточное ядро рано теряет тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней активизацией генома зародыша – уже на стадиях двух клеток. У других млекопитающих, в частности у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активизация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16 клеточной стадии. Возможно, поэтому первые значительные успехи в клонировании животных были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.

Тем не менее, особый интерес вызывают опыты группы учёных из университета в Гонолулу во главе с Риузо Янагимачи. Авторам удалось усовершенствовать метод Уилмута, о котором речь пойдёт ниже, они отказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической клетки с яйцеклеткой и изобрели такую микропипетку, с помощью которой можно было бы безболезненно извлекать ядро из соматической клетки и трансплантировать его в обезъядренную клетку. Кроме того, авторы использовали в качестве донорских относительно менее дифференцированные ядра клеток, окружающих ооцит. Наконец, удалось, как бы синхронизировать процессы, протекающие в яйцеклетке и трансплантируемом в нём ядре, что позволило обеспечить естественные ядерно-цитолазматические взаимоотношения между ядром и цитоплазмой, поскольку трансплантируемое дифференцированное в определённом направлении ядро и цитоплазма яйцеклетки до того работали как бы в разных режимах.

Авторы использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит (клеток так называемого cumulus oophorus), клеток Сертоли из семенников и клеток, выделенных из мозга. Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощью микропипетки. Яйцо активировали к развитию, поместив в специальный раствор (так называемый HEPES-CZB), свободный от кальция, и добавляя стронций и цитохалазин.Стронций активировал яйцо, а кальций подавлял образование полярных телец. Эмбрионов культивировали до стадии 2-8 клеток, морулы или бластулы, а затем трансплантировали в матку приёмной матери, где многие из них имплантировались и некоторые из них (15-16%) продолжали своё развитие. Процент выхода рождённых мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18, 5-19-й дни беременности) был, однако, низок – в разных сериях экспериментов от 2 до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядер рождённых мышат к клеткам донора соматических клеток.Таким образом, по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих.

Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления о методологии млекопитающих.