Анализ параметров клеточного цикла
Благодаря фундаментальным исследованиям в области экспериментальной биологии и клинической медицины были получены факты, касающиеся кинетики клеточного цикла.
К настоящему времени уже накоплен определенный опыт работы по данному вопросу. Практически не существует ни одного органа или ткани человеческого организма, экспериментального животного, который бы не подвергался цитометрическому или цитоспектрофотометрическому анализу. На основании этих данных установлено, что содержание ДНК нормальных соматических клеток соответствует диплоидному набору хромосом (2с) и характеризуется одним модальным классом на ДНК-гистограмме. Значение этого параметра для одного и того же индивида может колебаться в пределах 30%. Наиболее выраженные вариации в содержании ДНК наблюдаются в клетках пролиферирующих органов – печени и селезенки. Эти данные были получены при определении содержания ДНК в ядрах клеток различных органов и тканей фенотически здоровых людей (130 проб – по 5 – 14 от каждого случая)(E.Muller, R.Weidhase, 1983).
В изучаемых объектах схематически представлены фазы митотического цикла и распределение ДНК в различных тканях. Рассчитывалась кинетика клеточной пролиферации, а в патологически измененном органе – степень выраженности процесса, особенно в случае раковой опухоли.
Благодаря использованию в исследованиях сканирующих и проточных цитофотометров определены важные данные, касающиеся классификации клеток по фазам митотического цикла, а также получены результаты, позволяющие оценить продолжительность и дисперсию соответствующих фаз цикла G1, S, G2+M.
Однопараметрический анализ кинетики клеточного цикла по изучению содержания ДНК показал возможности количественной цитометрии и открыл широкие перспективы относительно его использования для исследования и углубления знаний по изучаемому вопросу.
В настоящее время появились данные, которые значительно расширяют традиционное представление, касающееся распределения клеток в четырех последовательных фазах цикла. Одновременное изучение двух параметров – ДНК и белка, ДНК и РНК – дает существенно больше информации о кинетике клеточного цикла, так как позволяет разделить сливающиеся фазы цикла, такие, как G0+ G1, G2+M, а также идентифицировать дополнительные фазы в пресинтетическом (G1) и постсинтетическом (G2) периодах. При анализе пресинтетического периода в эксперименте и клиническом материале была показана возможность использования АО (ДНК и РНК) для дополнительной классификации G1-периода на GIQ, GIA, GIB и G2A, G2B (Z.Darzynkiewicz, F.Traganos, M.R. Melamed, 1980).
На культуре клеток Hela с использованием меченых радиоактивных изотопов и проточной цитометрии выделены в постсинтетическом периоде клетки, относящиеся к ранней (G2A) и поздней (G2B) фазам клеточного цикла (O.C.Blair, R.T.Winward, J.L.Roti, 1979).
Pollack и др. (A.Pollac, H.Moulis, N.L.Block, G.L.Irvin, 1984) при цитометрическом анализе ДНК и белка (FITC/PI) в клетках трех различных экспериментальных моделей, включающих культуру лейкозных опухолевых клеток крыс FL4, микрокультуру лимфоцитов периферической крови человека HPBL, не стимулированных и стимулированных фитогемагглютинином (ФГА), а также материала солидной опухоли в виде перевивной аденокарциномы предстательной железы крыс R 3327=Q показал возможность разделения пресинтетического периода на три фазы, выделив в нем покоящиеся клетки GIQ, ранние GIA и поздние G2B клетки, в постсинтетическом периоде были соответственно выделены ранние G2А и поздние G2B клетки. Для задержки вхождения клеток в S-фазу использовали актиномицидин D, оксимочевину, для блока митотических клеток применяли колцемид.
В работе также представлены данные, свидетельствующие о возможности классификации пролиферирующих лимфоидных и лейкозных опухолевых EL4-клеток в различные сроки культивирования на соответствующие S-фазы клеточного цикла с раздельным выделением в них M- и G2-фаз. Исходя из представленных данных, очевидно, что проточный цитометрический анализ по двум параметрам является одним из перспективных методов оценки кинетики клеточного цикла, позволяющий провести идентификацию клеток, находящихся в ранее неопределяемых фазах цикла (G1A, G1B и G2A, G2B), и определить клетки, находящиеся в фазах M и G2.
