Анализ параметров клеточного цикла
В некоторых работах клинического направления используется двухпараметрический анализ клеточного материала с достаточно успешной классификацией патологических процессов, например при распознавании доброкачественных и раковых процессов мочевого пузыря, шейки матки, а также для классификации различных форм гемобластозов.
В современной литературе весьма широко представлены данные по цитоспектрофотометрическому изучению интерфазных ядер. Следует отметить, что особую ценность представляют работы, направленные на изучение митотических клеток с последующим анализом хромосом. Известно, что изменения, регистрируемые в хромосомах, могут быть определяющими диагностическими маркерами опухоли, особенно на начальных этапах возникновения злокачественного процесса. Однако используемые методы анализа хромосомного материала сравнительно сложны и трудоемки. Поэтому в последнее время наряду с обычными цитогенетическими методами исследования кариотипа нормальных и малигнизированных клеток стали применяться сканирующие и проточные цитометрические анализаторы. Приборы последнего типа обеспечивают достаточно высокую точность и скорость измерения, а также воспроизводимость результатов. Скорость анализа хромосом в протоке составляет 1000 – 2000 хромосом в секунду. Проточный цитометрический анализ ДНК метафазных хромосом в суспензии является совершенно новым методом кариотипирования. Поэтому в исследованиях такого рода основной акцент делается на разработке эффективных методов сепарации интактных хромосом с сохранением их целостности и морфологической структуры.
В представленных работах чаще всего изучаемой моделью являются метафазные хромосомы, полученные из клеток китайского хомячка и человека, приготовленные для прямого кариотипирования, а также для анализа кариотипа с кратковременным или длительным культивированием клеток. Для анализа генетического материала используются однопараметрические проточные системы, где проводится анализ и сортировка хромосом по интенсивности флуоресценции в комплексе с такими флуорохромами, как PI, EtBr, Ho 33258, а также применяются высокоразрешающие проточные цитометры с двухлазерной системой, которые обеспечивают бивариантный анализ ДНК, меченный двумя флуорохромами. Большей частью используют сочетание Но 33258, специфически связывающийся с АТ-богатыми участками ДНК, и хромомицин А3, селективно взаимодействующий с ГЦ-парами.
Данные, полученные при помощи автоматизированных систем, представляются в виде гистограмм, так называемых проточных кариограмм. О качестве анализа свидетельствует высокое разрешение гистограмм, Которые характеризуются множественными узкими пиками, относящимися к различным классам хромосом. Количество пиков в большинстве случаев соответствует набору хромосом, которое характерно для данного индивидуума. При исследовании клеток зародыша китайского хомячка методом проточного кариотипирования на этапе экспоненциального роста были получены все 11 пиков, соответствующие 11 парам хромосом самки, исследуемого животного (J.A.Steinkamp, 1984).
Обычно применяемые цитогенетические методы не позволяют идентифицировать Y-хромосому из G- и F-групп хромосом человека. Применение проточной цитометрии позволяет решить эту задачу. Так, на лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров-мужчин, с кратковременным культивированием (52 ч) и добавлентем колцемида была показана возможность определения позиции Y-хромосомы по интенсивности ДНК-флуоресценции (Но 33258) в виде пика на проточной кариограмме. У 17 обследуемых доноров позиция Y-хромосомы на гистограмме варьировала. В некоторых наблюдениях пик Y-хромосомы находился между 19 и 20 хромосомами, в других – между 20-й и 17-й. В 70% случаев Y-хромосома была контаминирована с 20-й.
Из работ, посвященных хромосомному анализу, известно, что при использовании однолазерной проточной системы может быть идентифицировано около 15 хромосом человека, исключая Y-хромосому. Применение двухлазерной системы (FACS-11) позволяет по интенсивности флуоресценции распознать около 20 популяций хромосом в метафазных пластинках и, что особенно ценно, идентифицировать маленькие аутосомы человека (M.Lalande, R.R.Schreck, R.Hoffman, S.A. Latt, 1985). В этом случае помимо флюорохромов Но 33258 и хромомицина А3 в комплекс субстрат-флюорохром вводится третий краситель: нетропсин или дистамицин А. Это способствует получению дополнительной информации о специфике хромосом, т.е. определению структурных особенностей нормальных и атипических хромосом. В результате бивариантного проточного анализа с дополнительной окраской хромосом авторам удалось на модели клеточной линии человеческих лимфобластов получить высокое разрешение метафазных пластин с последующим изучением структурной перестройки хромосом и идентификацией аномальных.
